實時熒光PCR試劑盒作為現代分子生物學領域的重要工具，憑借其特殊的工作原理和優勢，在疾病診斷、基因表達分析、病原體檢測等多個領域發揮著關鍵作用。核心在于其能夠實時監測DNA或RNA的擴增過程，并將擴增信號轉化為可量化的熒光信號。其原理主要基于以下兩個關鍵技術：
 

　　1.熒光共振能量轉移(FRET)：試劑盒中的熒光探針由報告基團和淬滅基團組成。當探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，此時儀器檢測不到熒光信號。在PCR擴增過程中，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成同步。
 

　　2.定量原理：通過監測熒光信號的強度，可以實時了解PCR擴增的進程。在PCR反應的指數擴增階段，熒光信號的強度與起始模板的數量呈正相關。通過標準曲線法，即使用已知濃度的標準品制作標準曲線，可以將未知樣品的Ct值(熒光信號達到設定閾值時的循環數)與標準曲線進行比較，從而計算出未知樣品的起始拷貝數。
 

　　實時熒光PCR試劑盒的測定步驟：
 

　　-分區操作：實驗室應分為試劑準備區、樣本制備區、擴增區和產物分析區。使用實時熒光PCR儀時，擴增區與產物分析區可合并。
 

　　-試劑解凍：從-20℃冰箱取出試劑盒，室溫解凍約15分鐘。振蕩混勻5秒，離心5秒使管壁液體集中。
 

　　-樣本處理：將病毒采樣管在旋渦混合儀上震蕩5秒混勻。
 

　　-核酸提取：按照試劑盒說明書進行RNA或DNA的提取和純化。
 

　　-根據試劑盒說明書中的配方，將DNA模板、引物、探針、酶等成分按比例加入PCR管中，制成PCR反應液。
 

　　-將配制好的PCR反應液加入PCR管中，然后加入適量的礦物油(如果需要)以防止蒸發。
 

　　-將需要的實驗參數輸入PCR儀中，包括變性溫度、退火溫度、延伸溫度以及循環次數等。
 

　　-將PCR管放入PCR儀中，啟動程序開始擴增。
 

　　-擴增結束后，根據標準曲線對未知樣品進行定量分析。